TFF ٹینجینٹل فلو فلٹریشن کو الٹرا سینٹرفیوگریشن کے ساتھ مل کر چھوٹے ایکسٹرا سیلولر ویسیکل کی موثر تیاری کے لیے

چھوٹے ایکسٹرا سیلولر ویسیکلز (sEVs) نانوسکل ویسیکلز ہیں جو خلیات کے ذریعے خفیہ ہوتے ہیں جن میں نیوکلک ایسڈ، پروٹین، چھوٹے مالیکیولز اور دیگر اجزاء ہوتے ہیں، اور انٹر سیلولر کمیونیکیشن میں اہم کردار ادا کرتے ہیں۔ Exosome-قسم کے چھوٹے ایکسٹرا سیلولر ویسکلز اپنے پیرنٹ سیلز کے ساتھ اعلیٰ مماثلت رکھتے ہیں۔ مصنوعی نینو پارٹیکلز کے مقابلے میں، وہ کم مدافعتی کلیئرنس کی شرح اور کم سائٹوٹوکسائٹی کو ظاہر کرتے ہیں، جو انہیں ناول کے طور پر امید افزا امیدوار بناتے ہیں۔Vivo منشیات کی ترسیل کی گاڑیوں میں. تقریباً تمام قسم کے خلیے ان vesicles کو خارج کر سکتے ہیں، اور ان کے استعمال پر تحقیق کی جا رہی ہے کیونکہ منشیات کے کیریئر لیبارٹری سے بتدریج کلینیکل ایپلی کیشنز کی طرف بڑھ رہے ہیں۔ تاہم،بڑے-پیمانے پر پیداوار ایک بڑی رکاوٹ بنی ہوئی ہے۔.

 

ایکسٹرا سیلولر ویسیکل آئسولیشن کے موجودہ طریقے

موجودہ extracellular vesicle تنہائی کے طریقوں میں شامل ہیںالٹرا سینٹرفیوگریشن، کثافت گریڈینٹ سینٹرفیوگریشن، سائز-اخراج کرومیٹوگرافی (SEC)، اور پولیتھیلین گلائکول (PEG) ورن.

پی ای جی بارش زیادہ پیداوار اور آسان آپریشن پیش کرتی ہے، لیکن اس کا تعلق غیر مطلوبہ پروٹینوں کے ذریعے نمایاں آلودگی سے ہے۔ کثافت گریڈینٹ سینٹرفیوگریشن اور سائز-اخراج کرومیٹوگرافی اعلی-پاکیزگی کی مصنوعات فراہم کر سکتی ہے، لیکن ان کی کارکردگی نسبتاً کم ہے اور عمل میں وقت لگتا ہے-۔ الٹرا سینٹرفیوگریشن کا بڑے پیمانے پر استعمال کیا جاتا ہے، لیکن اس کی پروسیسنگ والیوم سینٹرفیوج کی صلاحیت کے لحاظ سے محدود ہے، جس کی وجہ سے اسے بڑھانا مشکل ہو جاتا ہے۔

 

sEV علیحدگی کے لیے ٹینجینٹل فلو فلٹریشن کا اطلاق

ٹینجینٹل فلو فلٹریشن (TFF) پہلے ہی نینو پارٹیکلز جیسے لیپوسومز اور لینٹیو وائرل ویکٹر کی علیحدگی پر لاگو کیا جا چکا ہے۔ TFF میں، فیڈ جھلی کی سطح پر مبہم طور پر بہتی ہے، جس سے جھلی کی خرابی کو کم کرنے میں مدد ملتی ہے اور اس عمل کو بڑھانے میں آسانی ہوتی ہے۔

چھوٹے extracellular vesicles کے بعد سے عام طور پر رینج30-200 nmقطر میں، a0.45 μm جھلی کیسٹTFF سسٹم میں بڑے پروٹین اور ویسیکلز کو ہٹانے کے لیے منتخب کیا جا سکتا ہے، جبکہ a300 کے ڈی اے میمبرین کیسٹچھوٹے مالیکیولر-وزن پروٹین کو ہٹانے اور کلچر میڈیم میں موجود چھوٹے ایکسٹرا سیلولر ویسیکلز کو مرتکز کرنے کے لیے استعمال کیا جا سکتا ہے۔

 

TFF علیحدگی کے بعد خام مال کی خصوصیت

نینو پارٹیکل ٹریکنگ تجزیہ (NTA) سے پتہ چلتا ہے کہ ذرہ قطر بنیادی طور پر کی حد کے اندر تقسیم کیا گیا تھا0–250 nm.

 

 

تاہم، ٹرانسمیشن الیکٹران مائیکروسکوپی (TEM) نے آلودہ کرنے والے پروٹین کی ایک بڑی مقدار کا انکشاف کیا، جب کہ کسی بھی خلیے کے خلیے کا مشاہدہ نہیں کیا گیا۔ ان نتائج نے اشارہ کیا کہ ایکسٹرا سیلولر ویسیکلز کو مزید پاک کرنے کے لئے ایک اضافی بہاو صاف کرنے کے قدم کی ضرورت تھی۔

 

100 kDa الٹرا فلٹریشن کے بعد TFF توجہ مرکوز کی خصوصیت

TFF توجہ مرکوز پر مزید کارروائی a کا استعمال کرتے ہوئے کی گئی۔100 kDa الٹرا فلٹریشن ٹیوب.

این ٹی اے نے ظاہر کیا کہ الٹرا فلٹریشن کے ایک اور دو راؤنڈ کے بعد حاصل ہونے والے ارتکاز میں ذرہ کا قطر بنیادی طور پر کی حد کے اندر رہا۔0–250 nm. تاہم، دو بار الٹرا فلٹریشن کرنے کے نتیجے میں حاصل ہونے والے ذرات کی تعداد میں نمایاں کمی واقع ہوئی۔

TEM تجزیہ سے پتہ چلتا ہے کہ ایک-وقت یا دو-وقت کے الٹرا فلٹریشن مرتکز میں کوئی ویسیکل-جیسے ڈھانچے کا مشاہدہ نہیں کیا گیا، جبکہ کافی مقدار میں آلودہ پروٹین باقی ہے۔

لہذا،TFF ارتکاز کے بعد کلچر میڈیم کو صاف کرنے کے لیے 100 kDa الٹرا فلٹریشن کو مؤثر طریقے سے استعمال نہیں کیا جا سکا.

 

 

الٹرا سینٹرفیوگریشن کے ذریعہ پیوریفائیڈ TFF کنسنٹریٹ کی خصوصیت

NTA نے ظاہر کیا کہ صاف شدہ مصنوعات کے ذرہ قطر بنیادی طور پر کی حد کے اندر تقسیم کیے گئے تھے0–250 nm.

اہم بات یہ ہے کہ، TEM نے واضح طور پر vesicle-جیسے ڈھانچے کو مختلف شعبوں میں ظاہر کیا۔ ان نتائج نے ظاہر کیا کہ TFF کا استعمال کرتے ہوئے کلچر میڈیم کو مرتکز کرنے کے بعد،الٹرا سینٹرفیوگریشن کو بعد میں ایکسٹرا سیلولر ویسکلز کی مزید علیحدگی اور صاف کرنے کے لیے استعمال کیا جا سکتا ہے۔.

 

 

الٹرا سینٹرفیوگریشن کے ساتھ مل کر TFF کا استعمال کرتے ہوئے Mesenchymal اسٹیم سیل کنڈیشنڈ میڈیم سے الگ تھلگ sEVs کی خصوصیت

NTA نے ظاہر کیا کہ صاف شدہ مصنوعات کے ذرہ قطر بنیادی طور پر کی حد کے اندر تقسیم کیے گئے تھے0–250 nm.

ویسیکل-جیسے ڈھانچے کا مشاہدہ TEM نے کیا۔ مغربی دھبے کے تجزیے نے ایکسٹرا سیلولر ویسیکل-متعلق پروٹین کے مثبت اظہار کا مظاہرہ کیاCD9، CD63، اور ALIXصاف شدہ خارجی خلیوں میں۔

ان نتائج نے اس بات کی تصدیق کی کہ صاف شدہ چھوٹے ماورائے خلوی ویزیکلز میں exosomes ہوتے ہیں، جو اس بات کی نشاندہی کرتے ہیں کہ یہ طریقہ کار کے لیے بھی استعمال کیا جا سکتا ہے۔exosome تنہائی اور نکالنے.

 

 

نتیجہ: اعلیٰ-معیاری sEV تیاری کے لیے TFF الٹرا سینٹرفیوگیشن کے ساتھ مل کر

مطالعہ نے یہ ظاہر کیا۔اکیلے TFF حراستیاس کے نتیجے میں ایک ایسی مصنوع پیدا ہوئی جس میں کافی مقدار میں آلودہ کرنے والے پروٹین موجود تھے اور اس وجہ سے کوالیفائیڈ ایکسٹرا سیلولر ویسیکلز حاصل کرنے کے لیے ناکافی تھے۔

اسی طرح، استعمال کرتے ہوئے aثانوی طہارت کے لیے 100 kDa الٹرا فلٹریشن ٹیوبمؤثر طریقے سے برقرار vesicle ڈھانچے کو حاصل نہیں کیا.

بعد میں الٹرا سینٹرفیوگریشن پیوریفیکیشن کے ساتھ TFF ارتکاز کو ملا کر، دونوں تکنیکوں کے فوائد کو حاصل کرنے کے لیے مربوط کیا جا سکتا ہے۔اعلی-معیاری چھوٹے خلوی خلیے کی مصنوعات.

اکیلے روایتی ultracentrifugation کے ساتھ مقابلے میں، مشترکہ عمل مؤثر طریقے سے کر سکتے ہیںپروسیسنگ کے مجموعی وقت کو کم کریں اور علیحدگی کی کارکردگی کو بہتر بنائیں.

اس ورک فلو میں،TFF بڑے- حجم کے نمونوں کی تیزی سے افزودگی کو قابل بناتا ہے۔, بڑے نمونے والیوم کی پروسیسنگ میں روایتی الٹرا سینٹرفیوگریشن کی حد کو دور کرنا۔ اس کے بعد الٹرا سینٹرفیوگریشن گہرائی سے تطہیر کا کام کرتا ہے تاکہ رگوں کی پاکیزگی اور سالمیت کو برقرار رکھنے میں مدد کرتے ہوئے co-متمرکز پروٹین کی نجاست کو دور کرے۔

مزید برآں، عمل میں اضافے کی ضرورت نہیں ہے۔خارجی کیمیائی ترسیب ری ایجنٹس, vesicles کی حیاتیاتی سرگرمی کو ممکنہ حد تک محفوظ رکھنے میں مدد کرنا۔

صنعتی ترجمہ کے نقطہ نظر سے، یہ عمل اہم ہےپیمانہ-اپنا امکاناور ایکسٹرا سیلولر ویسکلز کی بڑے پیمانے پر-پیداوار سے وابستہ چیلنجوں سے نمٹنے میں مدد کر سکتا ہےمنشیات کی ترسیل، دوبارہ پیدا کرنے والی دوا، اور متعلقہ مصنوعات کی ترقی. یہ بعد کے عمل کی اصلاح اور پائلٹ-پیمانہ سازی کے لیے ایک ٹھوس تجرباتی بنیاد بھی فراہم کرتا ہے۔

 

حوالہ

وانگ لنگ، لی مینگشی، سو شا، وغیرہ۔الٹرا سینٹرفیوگریشن کے ساتھ مل کر ٹینجینٹل فلو فلٹریشن کے ذریعہ چھوٹے ایکسٹرا سیلولر ویسیکلز کو الگ کرنے کے طریقہ کار کا قیام۔ چائنیز جرنل آف بائیولوجیکل، 2022، 35(9): 1096–1101۔ DOI: 10.13200/j.cnki.cjb.003713۔